2009 동대학술상 자연과학부문 장원 - 이송희

식물생장조절제(PGRs; Plant Growth Regulators)에 따른 갈매보리수나무(Hippophae rhamnoides L.)의 체세포배 유도 및 발아

 The effects of Plant Growth Regulators on somatic embryogenesis

in Hippophae rhamnoides L.

요약

본 연구는 식물생장조절제가 몽골산 갈매보리수나무의 체세포배 유도 및 발아에 미치는 영향을 알아보기 위해 수행되었다. GA3와 Filterpaper 처리가 갈매보리수나무 종자 발아에 미치는 영향에 대해 알아보기 위해 White 기본배지에 3% sucrose, 0.3% gelrite에 1.0 mg/L GA3 첨가․무 첨가, Filterpaper 처리와 무 처리군을 두었다. 그 결과 GA3 무 첨가와 Filterpaper의 처리에서 가장 높은 발아율(47.5%)을 보였다. 식물생장조절제에 따른 체세포배 유도는 기내에서 발아된 자엽과 줄기를 이용하였으며 SH 기본배지에 3% sucrose, 0.3% gelirte를 첨가하였고 식물생장조절제는 BA(1.0, 2.0 mg/L) + IAA(0.5, 1.0 mg/L), Kin(1.0, 2.0 mg/L) + IAA(0.5, 1.0 mg/L)를 첨가하였다. 2.0 mg/L BA + 1.0 mg/L IAA 처리구에서 가장 높은 체세포배 유도율(77.8%)을 얻었다. 체세포배 발아는 2.0 mg/L Kin + 1.0 mg/L IAA에서 8.8%의 결과를 얻었다.

  Ⅰ. 서론

갈매보리수나무(Hippophae rhamnoides L.)는 보리수나무과(Elaeagnaceae)에 속하는 낙엽활엽관목으로 높이 2〜4m 정도로 자라며, 암․수가 다른 자웅이주이며 가지가 길고 갈색의 가시가 있는 것이 특징이다. 잎은 은회색의 피침형으로 좁게 호생(互生)하며, 열매는 4월과 10월경에 수확한다. 유럽과 중국, 몽골, 러시아 등지에 분포하며 현재까지 알려진 바에 의하면 6종 12아종이 있다(Rousi, 1971; Li and Schroeder, 1996; Merja et al., 2006; Richard and Paul, 2008). 영하 40℃에서도 생육이 가능할 정도로 내한성이 강한 식물일 뿐 아니라 내염성과 내건성도 강한 식물이다. 질소고정능력을 가지고 있어 영국에서는 해변 사구에 식재했을 뿐만 아니라, 중국에서는 이미 오래전부터 사막화 방지 사업에 적극 활용되고 있다(Heinze and Fiedler, 1981; Lu et al., 1997; 김경민 외, 2009). 특히 갈매보리수나무의 열매와 잎에는 비타민이 풍부하여 우리나라에서는 비타민나무라고 널리 알려져 있다. 갈매보리수나무의 열매에는 탄수화물, 단백질, 유기산 및 비타민 C가 풍부하여 과거에는 영양실조를 예방하기 위해 갈매보리수나무의 열매를 먹었으며(Bernath and Foldesi, 1992), 면역력 증진제로 사용되었으며 피부병치료제와 소화촉진제로 사용되었다(Paul, 2001; Sea Buckthorn- a source of Sea Buckthorn oil, alternative medicines, diet supplements, 2009). 뿐만 아니라 갈매보리수나무 열매는 지방산의 함량이 높으며 항산화성 생리활성물질이 풍부하다(Yang et al., 2001; Kallio et al., 2002; Yang and Kallio, 2002). 갈매보리수나무 열매 오일은 화상, 상처, 습진 등을 치료하는데 사용되며, 상처 조직의 재생 촉진능력을 가지고 있어(Li et al., 1996) 중국, 러시아, 몽골 등지에서는 구내염, 질염 등의 염증과 화상, 궤양 치료제로 사용되고 피부질환 및 모발손상 예방용 제품의 첨가물로도 이용되고 있다(Letchamo et al., 2002) 게다가 주름개선에 효과적이기 때문에 미국, 캐나다, 러시아, 유럽 등과 같은 지역에서 화장품 원료로 이용되고 있다(Li and Beveridege 2003; Jeppsson, 2008). 이와 같이 현재 갈매보리수나무에 대한 화학적 성분과 효능에 대한 연구(Guliyey et al., 2004; 김경민 외, 2009)는 활발히 진행되고 있는 반면 갈매보리수나무의 신품종 개발이나 대량묘목생산, 클론확보, 유용유전자원 보존 등에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 갈매보리수나무의 클론별 유전자원 보존과 신품종 개발 및 대량생산을 위해서는 식물조직배양 기법이 도입되어야 하나(Yang et al. 2004), 지금까지 갈매보리수나무의 기내배양에 관한 연구는 지역 클론별(중국산, 인도산, 유럽산)로 연구가 수행되었을 뿐 매우 미흡한 실정이다(Paul, 2001; Gupta and Singh, 2003, 2008; Liu et al., 2007; Sridevy and Lundquist, 2009). 따라서 보다 다양한 클론별의 유전자원 확보와 다양성보존을 위해 더 많은 연구가 진행되어야 한다. 특히 갈매보리수나무의 고유종을 지니고 있는 몽골은 사막화의 급속한 진행으로 몽골 자생종 갈매보리수나무의 다양성이 점차 사라질 것으로 예측되기 때문에 몽골 자생종에 대한 유전자원의 보존적 측면에 관한 연구가 필요하다. 따라서 식물생장조절제(PGRs; Plant Growth Regulators)에 따른 갈매보리수나무의 기내배양(In vitro)조건을 구명하여 기초자료로 활용하고자 본 연구를 수행하였다.

  Ⅱ. 본론

  1. 공시재료 및 실험 방법

1) 공시재료

2008년 9월 몽골지리생태연구소에서 구입한 갈매보리수나무 종자를 공시재료로 이용하였다.

  2) 기내(In vitro) 종자 발아

GA3(Gibeberellic Acid)와 Filterpaper가 갈매보리수나무 기내 종자 발아에 미치는 영향을 알아보기 위해 실험을 실시하였다. 갈매보리수나무의 종자발아에 있어 White(White, 1963) 배지가 효과적인 연구(이소라와 장현정, 2008)를 토대로 White 기본배지에 3% sucrose, 0.3% gelirte, pH는 6.0으로 조절하고 121℃, 1.2기압에 20분 고압 멸균처리(Autoclave)하였다. GA3에 따른 발아율을 살펴보기 위해 1.0 mg/L GA3의 첨가, 무 첨가군을 두었다. petridish(100 ×20 mm)에 분주 된 배지 위에 Filterpaper를 두어 발아에 미치는 영향을 살펴보았다. 종자소독은 갈매보리수나무 종자를 30분간 수돗물에 수세한 후, 70% 에탄올(EtOH)에 30초간 침지시켜 종자소독전처리를 하였다. 4% NaOCl 용액에 15분간 2회 침지처리한 후, 종자를 메탄올 표면가열처리법으로 멸균된 배지에 치상하였다.

  3) 체세포배 유도 및 발아

기내에서 발아된 자엽과 줄기를 시료를 이용하여 체세포배를 유도시켰다. SH(Schenk & Hildebrandt, 1972) 기본배지에 3% sucrose, 0.3% gelrite 첨가한 후 식물생장조절물질에 따른 체세포배 유도를 조사하기위해 각각 1.0, 2.0 ㎎/L Kin(Kinetin)과 0.5, 1.0 ㎎/L IAA(3-indole-acetic acid) 그리고 1.0, 2.0 ㎎/L BA(6-benzylaminopurine)와 0.5, 1.0 ㎎/L IAA를 각각 혼합하여 pH는 6.0으로 조정하였다. 자엽과 줄기에 기계적 가상처리로 한 후 배지에 치상하였으며 4주 간격으로 계대배양을 실시하였다. 또한 배지와 GA3의 농도에 따른 체세포배 발아를 관찰하였다. 배지는 SH 배지와 WPM 배지에 각각 3% sucrose를 첨가하고 pH 6.0으로 조정한 후, 1.0% bacto-agar로 경화시켰다. Autoclave 멸균 후 각각 GA3을 필터링처리(Whatman, 20㎛)로 멸균 후 1.0, 3.0 mg/L을 첨가하여 petridish(90 × 15 mm)에 분주하였다.

  4) 유식물체신장

sucrose가 유식물체의 신장에 미치는 영향을 알아보기 위해 SH 기본배지에 3% sucrose와 sucrose 무첨가를 대조군으로 설정하였다. 0.3% AC(Activated chacoal)를 첨가하고, pH는 6.0으로 조절하였으며 0.35%의 gelrite로 경화시켰다. 121℃, 1.2기압에서 20분간 Autoclave 후 GA3가 유식물체 신장에 미치는 영향을 알아보기 위해 3.0 mg/L GA3를 첨가하고 GA3 무첨가를 대조군으로 설정하였으며 유리 시험관(25 × 150 mm)에 분주 후 치상하였다.

2. 결과 및 고찰

1) 기내(In vitro) 종자 발아

GA3 유·무 처리와 Filterpaper의 유·무 처리에 따른 갈매보리수나무의 기내 종자발아실험에서 5일후부터 발아가 시작되었다. 종자 발아율은 Table 1에서 보는 것과 같이 GA3 무 첨가와 Filterpaper를 처리한 배지에서 가장 높은 발아율(47.5%)을 확인하였다. 지금까지 GA3는 종자 발아를 촉진 하는 것으로 알려져 있지만 갈매보리수나무의 기내 종자발아 실험에 있어 GA3 첨가와 무 첨가는 큰 영향을 미치지 않았으며, Filterpaper 처리가 종자발아에 더 큰 영향을 미치는 것으로 조사되었다(Table 1).

갈매보리수나무 기내 종자발아의 오염율은 GA3 무 첨가와 Filterpaper 무 처리에서 가장 높았으며(39.8%), 1.0 mg/L GA3와 Filterpaper 무처리에서 가장 낮은(21.2%)결과를 나타내었다. 갈매보리수나무의 기내 종자 발아시 오염율은 Filterpaper 처리로 오염율이 감소할 것으로 예측하였지만, Filterpaper는 오염율에 직접적인 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 오염 원인은 배지에 포함된 당성분인 sucrose와 종자가 접촉하고, 발아하면서 오염에 영향을 미쳤을 것이라고 예측된다. 갈매보리수나무의 종자 발아시 오염되지 않았지만 일부 종자에서 종자 주변 배지가 갈색으로 변하는 것을 발견하였다. 이는 Sridevy와 Lundquist(2009)의 연구에서 환경적 조건인 빛이 부족한 경우 갈매보리수나무 종자에서 페놀성 물질을 방출하기 때문에 배지가 갈색으로 변한다고 보고한 것과 유사한 결과로서 추후 환경적 조건을 조절하여 갈매보리수나무의 종자 발아율을 높이는 연구가 필요하다. 

2) 체세포배 유도 및 발아

갈매보리수나무의 기내배양시 배지의 영양성분과 식물생장조절제가 필수적이며(Gupta and Singh, 2003), 식물생장조절제중 BA와 Kin을 단독 처리할 경우 기내배양에서 효율이 떨어진다는 연구결과가 보고된 바 있다(Montpetit and Lalonde, 1998; Knyanzev et al., 2003; Yang et al., 2004; Singh and Gupta, 2008). 따라서 몽골산 갈매보리수나무의 체세포배를 유도하기 위해 식물생장조절제를 혼합한 Kin + IAA 농도, BA + IAA 농도 차에 따라 체세포배의 유도를 관찰하였다. 종자 발아에서 얻은 자엽과 줄기를 체세포배 유도 배지로 옮겨 준 3주 후부터 체세포배가 유도되었으며 배양 7주후가 경과되었을 때 최고 유도율을 확인할 수 있었다. 식물생장조절제에 있어 갈매보리수나무의 체세포배 유도시 BA가 Kin보다 효과적이었다. 중국산 클론(Liu et al., 2007)에 대한 체세포배 유도에 관한 조건은 1.0 mg/L Kin + 0.5 mg/L IAA (86.3%)가 가장 적합한 것을 보인 반면에 몽골산 종자의 체세포배 유도는 2.0 ㎎/L BA + 1.0㎎/L IAA (77.8%)가 가장 효과적임을 알 수 있었다. 이는 배양체의 클론 간의 차이에서 기인된 것으로 판단된다. 체세포배 유도배지에서 지속적인 계대배양을 실시한 결과 체세포배 발아가 진행되었으며, 2.0 ㎎/L Kin + 1.0 ㎎/L IAA 처리구에서 8.8%의 체세포배 발아율을 나타내었다(Table 2). 따라서 체세포배 발아율을 더 증가시키기 위한 추가적 실험이 필요하다고 판단된다.

한편 SH 배지와 WPM 배지의 차이에 따른 체세포배의 발아율은 큰 차이를 보이지 않았으며, GA3의 농도 차에 따른 갈매보리수나무의 발아율을 조사하였을 때, GA3 농도는 체세포배 발아에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었으며, 식물생장조절제에 따른 갈매보리수나무 체세포배 발아는 GA3보다 2.0 mg/L Kin + 1.0 mg/L IAA와 1.0 mg/L BA + 0.5 mg/L IAA를 첨가한 경우가 상대적으로 높았다(Table 3).

3) 유식물체신장

유식물체 신장단계에서 sucrose 무첨가 조건에서의 식물체는 일주일 후 고사하였으며, 3% sucrose, 0.3% AC와 3.0 mg/L GA3을 첨가한 배양조건에서 역시 배양조건이 적합하지 않아 활력을 잃고 일주일 후부터 잎이 갈변화 현상과 chlorotic 현상이 유발되어 결국 고사하였다. 이는 유럽산 클론의 기내배양 유식물체 신장은 WPM배지에 1.0 mg/L GA3와 1.0 mg/L BA의 조건에서 유식물체의 신장을 촉진하는데 가장 효과적이지만, 결국 chlorotic 현상을 야기시킨 보고와 유사한 결과(Sridevy and Lundquist, 2009)로 갈매보리수나무의 유식물체 신장을 위해 추가적인 연구가 필요한 것으로 보인다. 이렇게 배양 중인 줄기가 갈변되거나 chlorotic 현상이 유발되어 고사하는 현상은 줄기괴저(STN, Shoot Tip Necrosis)현상으로 뿌리가 생성되지 않은 줄기부분을 배양 할 때 줄기신장을 도와주는 호르몬인 시토키닌을 합성하지 못하고, 특히 세포벽의 형성과 무기염류의 수송을 담당하며 식물호르몬의 합성에 관여하는 Ca+의 흡수를 효율적으로 하지 못해(Hirschi 2004; Hepler 2005, Martin et al., 2007) 줄기의 정상 부근에서부터 갈변화가 진행되어 서서히 고사하는 현상을 뜻한다(McCown and Sellmer. 1987). 본 연구에서도 갈매보리수나무 체세포배 발아시 뿌리가 형성되지 않고 줄기만 형성되어 이를 뿌리유도 단계 없이 시토키닌이 첨가되지 않은 신장배지에 옮겨 시토키닌과 Ca+ 결핍에 의한 줄기괴저 현상이 발생한 것으로 추측된다. 따라서 시토키닌과 Ca+ 첨가를 통한 줄기괴저를 방지하여 정상적인 묘목을 얻는 연구가 필요하다고 판단된다.

Ⅲ. 결론 

GA3의 첨가․무 첨가와 Filterpaper의 유·무 처리에 따른 갈매보리수나무의 기내 종자발아실험 결과, Filterpaper를 처리한 GA3 무 첨가 배지에서 가장 높은 발아율을 보였고, 오염율은 GA3 무 첨가와 Filterpaper 무 처리에서 가장 높았다. 따라서 갈매보리수나무의 기내 종자발아에 GA3은 영향을 미치지 않는 것을 알 수 있었다.

식물생장조절제에 따른 갈매보리수나무의 체세포배 유도는 2.0 ㎎/L BA + 1.0㎎/L IAA에서 가장 높은 유도율을 보였고, 체세포배의 발아는 2.0 ㎎/L Kin + 1.0 ㎎/L IAA와 1.0 BA mg/L + 0.5 IAA mg/L의 조건에서 비슷한 발아율을 보였다. SH 배지와 WPM 배지와 GA3의 농도에 따른 체세포배 발아를 조사한 결과 배지의 종류에 따른 체세포배 발아율은 큰 차이를 보이지 않았으며, GA3농도도 큰 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다. 유식물체 신장 단계에서는 배양조건이 적합하지 않아 줄기괴저 현상이 발생하여 활력을 잃고 고사하였다. 따라서 몽골산 갈매보리수나무의 유전자원보전 및 활용을 위해 갈매보리수나무의 조직배양에 관한 지속적인 연구가 필요하다.

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