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[제48회 동대학술상]자연과학 부문 가작액아배양을 통한 백하수오(Cynanchum wilfordii)의 기내대량증식

 

 

서 론

백하수오(白何首烏, Cynanchum wilfordii Hemsley)는 박주가리과(Asclepiadaceae)에 속하는 덩굴성 다년생 초본으로 일본, 중국, 만주, 우수리 등지에 분포하며 우리나라에서는 큰조롱, 새박풀, 은조롱, 새조롱 등으로 불리며 전국 각지 양지바른 산기슭 풀밭 또는 바닷가 경사지에 분포한다.(이창복, 2003; 채영암 등, 2007). 이 속에 포함되는 종들 대부분이 유독식물로 분류되어 왔으나 예로부터 유독성분이 약으로 이용되는 경우가 많아 많은 나라에서 전통적으로 약용식물로 활용되어 왔다(Zhang et al., 2009). 우리나라 대표적 한방서인 동의보감(東醫寶鑑)에 의하면 하수오의 향약명을 ‘은조롱’과 ‘새박뿌리’라고 명명하였고, 황해도와 강원도에서 나며 익혈기(益血氣)하며 장근골(壯筋骨)하고 골수를 메우며 머리털을 검게하고 주안연년(主眼延年) 한다고 기록되어 있다(허준, 1994).

최근 들어 한방을 바탕으로 효능 검정에 관한 연구가 활발히 진행되고 있으며 백하수오 추출물에서 강력한 항산화작용과 칼슘 길항작용을 수행하는 것으로 보고되었으며(장기철과 이동웅, 2000), 추출엑기스를 이용하여 면역증강을 검증한 결과 항체 생성율이 150% 이상 증가하였다(한국과학기술원, 1993). 이외에도 고지혈증에 대한 억제효능(함인혜 등, 2007) 및 간과 위를 보하고 정과혈을 더해주는 효능이 있다고 보고되었다(신민교, 1985, 이영종과 손영종, 1999). 또한 김한수(2004)는 혈당 및 혈청의 지질 개선 효과, 아토피를 유발하는 알러지 관련 싸이토카인의 분비 및 생성을 억제하는 것을 보고하였다. 이상래 등(1993)은 한국산 항종양성 식물자원을 밝히는 연구에서 세포벽용적법과 배양세포에 의한 Screening결과 백하수오가 검정되었고, 성미경 등(2004)은 백하수오 열수추출물과 발효 제품이 대장암을 억제하는 기능을 보고하였다. 김세은 등(1997)은 식물의 암세포 다제내성 조절 활성을 검색하기 위한 실험에서 백하수오가 강력한 다제내성 조절 활성을 보이고 있음을 보고하였고, 특히 백하수오는 자연산의 경우 재배산에 비해 효능이 월등히 뛰어나다고 보고되었다(이동웅, 1995; 이동웅과 이원철, 1997, 한기성 등, 1998). 이와 같이 백하수오의 효능이 밝혀지면서 그 수요가 급증하고 있으며 특히 정보통신 및 교통의 발달로 자연산 백하수오 채취 동호회까지 만들어져 무단 불법채취가 공공연히 자행되어 자연산 백하수오는 점차 사라져가고 있다. 지금과 같은 추세로 불법채취 및 남획으로 인하여 자연산 백하수오가 멸종될 것으로 판단되며 일부시각에서는 이미 멸종위기에 처해 있다고 주장(아시아뉴스통신, 2009)하고 있으나 정확한 연구는 진행되지 않고 있다.

현재 시중에서는 백하수오와 약효 및 외형이 비슷한 이엽우피소(넓은잎큰조롱, Cynanchum auriculatum)를 중국으로부터 수입하여 우리나라에서 재배하고 있으며 국내 자급율이 약 100%에 이른다(김민자, 2006). 이엽우피소는 2008년부터 한약재로 인정받지 못하였지만(대한민국 정책포털, 2008) 증식 및 재배가 용이하기 때문에 이엽우피소를 재배하는 농가가 지속적으로 재배하여 백하수오로 둔갑하여 불법 유통함에 따라 한약재 시장에 부정적 영향을 미치는 문제점을 가지고 있다. 더구나 최근 들어 외형과 사용하는 부위가 비슷하기 때문에 구별이 쉽지 않은 점을 이용하여 재래시장에서 이엽우피소가 무분별하게 백하수오로 유통되며, 이름을 백수오로 바꾸어 백하수오와 혼동을 주는 형태로도 유통되고 있다. 따라서 이엽우피소를 재배하는 농가에 피해를 최소화하며 자생종 백하수오를 보급하기 위한 대비책과 신품종 육성관련 기술 및 멸종을 방지하기 위한 연구가 필요하다. 이를 위해서는 자생 백하수오 우량종을 발굴하여 신품종을 육성하거나 대량증식기술 개발을 통해 대량으로 보급하는 식물조직배양을 적용한 연구가 진행되어야 한다. 뿐 만 아니라 국내에서는 백수오와 백하수오에 대한 명칭통일이 되지 않아 혼란한 가운데 중국의 Shan등(2006)은 Cynanchum auriculatum, Cynanchum wilfordii, Cynanchum bungei를 모두 중국 자생 수종 및 전통약재인 백수오 “Baishouwu"로 명명하여 성분분석과 쥐를 대상으로 gastric lesion에 대한 실험을 진행하였고, 성분과 효능 측면에서 백하수오(Cynanchum wilfordii)가 가장 뛰어난 결과를 국제 학회지에 보고하여 자생식물에 대한 주도권을 축적하였다. 이에 우리나라도 하루 빨리 국내 하수오의 근원종인 백하수오에 대한 주도권을 축적할 필요성이 제기된다.

지금까지 백하수오에 관한 연구는 주로 성분 분석(이동웅, 1995; 이동웅과 이원철, 1997; 이혜원 등, 2008)과 재배기술 개선에 관한 연구(최인식 등, 1995; 김민자 등, 1999; 김민자 등, 2003)가 주를 이루고 있으나, 조직배양기술을 적용한 연구는 보고되지 않은 실정이다. 따라서 본 연구는 우량 및 야생 백하수오를 식물생명공학기술을 적용하여 대량생산 체계를 구축하고 식물체를 대량 생산함으로써 실제 재배지 및 재배 농가에 공급하고 자생식물자원보존 및 관련 자료축적을 위한 기초연구로서 기내 액아배양을 통한 대량증식 체계를 확립하기 위해 수행하였다.

 

 

재료 및 방법

1. 공시재료 및 다경유도

이수광 등(2010)의 연구를 통해 실험실에서 계대배양되고 있는 백하수오의 액아를 대상으로 다경유도를 위한 목적으로 실험을 실시하였다. 다경유도는 1/2 MS 기본배지에 탄소원으로서 sucrose와 glucose의 차이, KIN(Kinetin) 농도(0, 1.0, 5.0 mg/L) 및 환기처리를 달리하여 실시하였으며 조제된 배지를 0.35% gelrite로 경화시키켰다. 배양 시료는 액아 절편을 1 cm 크기로 잘라 각 처리구당 4개씩 3반복 하여 치상하였다. 사용된 모든 배지는 magenta-box(65 ×65×100 mm)에 분주하여 배양하였으며, pH는 멸균하기 전 5.7로 조절하였고 시료의 배양 조건은 1일 16시간 조명(40μmol m-2s-1)되고 온도는 24±2℃로 유지되는 배양실에서 배양하였다. 또한 오차를 줄이기 위해 3회 반복하여 실시하였다.

 

 

2. 발근유도

액아배양을 통해 2.5 cm 이상 자란 줄기를 대상으로 발근유도에 관한 실험을 수행하였다. 발근유도 조건은 탄소원 및 NAA 농도에 따른 차이를 비교하기 위하여 1/2 SH 배지에 0.2% AC를 첨가하고 탄소원으로 3% sucrose와 glucose, 0.1 mg/L, 1.0 mg/L의 NAA, 환기처리 유·무의 실험군을 설정하였다. 치상 4주 후 줄기 길이, 줄기 수, 뿌리 길이, 뿌리 수 및 발근율을 측정하였다.

 

 

3. 토양순화

각 조건에 따라 줄기와 뿌리가 총 4 cm 이상 발근이 진행된 유식물체를 시료로 사용하였으며 시료에 남아있는 배지를 완전히 씻어 낸 다음 대기순화 유무에 따른 토양순화 영향을 살펴보기 위하여 미사토와 일반 배양토를 달리하여 식재한 후 4주간 순화시켰다.

 

 

4. 통계처리

본 실험에 수집된 데이터는 평균(means)±표준오차(standard error)로 산출하였으며, 집단 간 변이를 알아보기 위해 일원배치 변량분석(one-way ANOVA)을 실시하였고, 유의성이 있는 경우 Duncan multiple range test(P=0.05)로 2차 검증하였다. 또한 모든 통계처리는 SPSS(ver. 12.0 Kor) 프로그램을 사용하였다.

 

 

결과 및 고찰

1. 다경유도

실험실에서 계대배양하고 있는 백하수오 액아를 줄기유도용 1/2 MS배지에 6주간 배양하였다(Table 1). 신초 길이는 탄소원과 순화처리에 상관없이 KIN 농도가 증가함에 따라 감소하였으며, 신초 수는 환기 무처리구에서 상대적으로 많이 발생하였다. 신초 수는 1.0 mg/L의 KIN이 첨가된 환기 무처리 glucose 첨가배지에서 3.5개로 가장 높았다. 하지만 glucose가 첨가되고 KIN 무처리 및 환기 무처리 대조구에서 신초길이가 2.8cm로 가장 길게 나타났을 뿐만 아니라 신초도 2개가 분화되어 좋은 결과를 나타내었다. 신초는 치상한 액아가 성장하면서 기부가 확대되고 확대된 기부에서 눈이 형성되는 것을 관찰 할 수 있었다. 일반적으로 씨토키닌은 지하부의 발육을 억제하고 지상부의 생육을 촉진한다고 알려져 줄기유도에 많이 활용된다(Short and Torrey, 1972). 박주가리과 식물의 액아유도에는 BA가 효율적이라고 보고(Sri Rama Murthy et al., 2010; Karuppusamy, 2009; Raghu Ramulu et al., 2002)되었으며 이수광 등(2010)의 연구에서는 BA 처리를 통해 2.4개, TDZ 처리로 2.1개가 유도된 반면 본 연구에서는 KIN 처리를 통해 상대적으로 다경유도(3.5개)에 효과적이었다. Komalavalli 와 Rao(2000)의 연구에서도 KIN 처리가 박주가리과 식물 Gymnema sylvestre의 액아유도에 효율적이라고 보고한 연구가 이를 뒷받침 한다.

환기처리는 경제비용 절감뿐만 아니라 기내 식물체를 정상적으로 신장 시켜주는 장점을 지니고 있어 최근 관련 연구가 활발히 진행되고 있다(최소라 등, 2005; 김지아와 문흥규, 2006). 씨토키닌이 첨가된 배지에서 식물체를 배양시키면 길게 신장되어 결국 고사하는데 환기처리 된 배양용기에서 배양하면 길게 신장되는 현상을 방지하며 잎 면적도 증가하고 토양 이식 후 생존율도 증가 시킬 수 있다고 보고(은종선 등, 1999; 이수광과 강호덕, 2009)된 바와 같이 본 실험에서도 환기 무처리 대조구가 환기처리 실험구보다 더 신장되는 것을 관찰 할 수 있었다. 또한 탄소원을 달리한 PGRs 무첨가군에서도 신초형성에 좋은 결과를 나타내어 이와 관련 연구를 더욱 추진해야 한다고 생각된다.

이상과 같이 박주가리과에 속하는 식물을 대상으로 기내 조직배양에 관한 연구가 여러 차례 보고되었으나 각 종에 따라 PGRs 및 첨가물과 배양환경에 대한 반응이 각기 다른 것으로 나타났다(Patil, 1998; Martin, 2003; Beena and Martin, 2003). 따라서 추후 보다 다양한 환경 요인에 관한 연구가 진행되어야 한다.

 

 

Carbon source (3%)

KIN (mg/L)

Ventilation

No. of shoot/explants

Shoot length(cm)

Sucrose

0

Con

1.33.±0.21c

2.81±0.31a

 

 

0

Ven

1.22±0.22c

2.38±0.13abc

 

 

1.0

Con

2.0±0.45bc

2.08±0.14bcd

 

 

1.0

Ven

1.5±0.22c

1.88±0.16cde

 

 

5.0

Con

2.0±0.57bc

1.75±0.48de

 

 

5.0

Ven

1.4±0.25c

1.6±0.13de

Glucose

0

Con

2.0±0.36bc

2.83±0.19a

 

 

0

Ven

1.22±0.22c

2.6±0.17ab

 

 

1.0

Con

3.5±0.45a

2.65±0.24ab

 

 

1.0

Ven

2.83±0.54ab

1.92±0.09cde

 

 

5.0

Con

3.2±0.58ab

1.7±0.11de

 

 

5.0

Ven

1.5±0.34c

1.37±0.07e

Values are means ± standard error.

Mean values followed by the same letter do not differ significantly according to Duncan's multiple range test at P=0.05.

 

 

2. 발근유도

발근유도를 위해 절편을 2.5 cm 크기로 절단하여 발근용 배지에 6주간 치상하였다(Table 2). Glucose를 첨가하고 1.0mg /L NAA, 환기 무처리 군에서 가장 높은 발근율(41%), 뿌리수(0.9개), 뿌리 길이(11 mm) 및 신초 길이(3.8 cm)를 나타내었다. 하지만 발근율은 41%로 저조하였으며 다른 처리구에서도 016%로 매우 저조하여 백하수오의 발근은 어려운 것으로 판단된다. 따라서 발근율과 뿌리 길이를 향상시키는 연구가 지속적으로 추진되어야 할 것으로 생각된다.

Lakshmi 등(2010)이 박주가리과 식물은 IBA 첨가 보다는 상대적으로 NAA 첨가시 발근율이 증가한다고 보고하였으며, 백하수오를 대상으로 IBA 보다 NAA 첨가시 발근이 진행되었다고 보고한 이수광(2010)의 연구가 이를 뒷받침한다.

배지 내의 활성탄 첨가는 배지에 빛의 투과를 방지하여 발근에 보다 효율적이라는 보고와 페놀성 물질과 에틸렌 가스 흡착 및 pH 균질화(Thomas et al., 2008) 등과 같은 이유로 조직배양에 널리 활용되고 있으며 박주가리과 식물에 대해서도 활성탄의 첨가가 발근에 효율적이라고 보고되어 있다(Sudha et al., 1998). 따라서 본 연구에서도 이수광 등의 연구(2010)보다 활성탄을 첨가하여 발근율을 높일 수 있었다.

탄소원으로서 glucose 첨가군이 sucrose 첨가군보다 신초의 개수, 길이, 발근율, 뿌리 길이에서 좋은 결과를 나타내어 glucose가 백하수오의 발근에 효과적인 것으로 판단된다.

Carbon source

NAA

(mg/L)

Ventilation

No. of shoot/explants

Shoot length

(cm)

No. of root/shoot

Root length

(mm)

Root formation

(%)

Sucrose

 

 

 

 

 

 

0.1

Con

2.0 ± 0.4

3.2 ± 0.2

0.4 ± 0.2

1.3 ± 0.4

16.7

0.1

Ven

1.8 ± 0.4

2.9 ± 0.2

0.3 ± 0.1

1.1 ±0.3

12.5

1.0

Con

2.0 ± 0.3

2.5 ± 0.2

0

0

0

1.0

Ven

1.6 ± 0.3

2.6 ± 0.2

0.1

1.3 ± 0.5

8.3

Glucose

 

 

 

 

 

 

0.1

Con

2.3 ± 0.4

3.3 ± 0.2

0.3 ± 0.1

2.4 ± 0.7

8.3

0.1

Ven

2.0 ± 0.3

3.1 ± 0.2

0

0

0

1.0

Con

2.1 ± 0.3

3.8 ± 0.4

0.9 ± 0.3

11.2 ± 3.1

41.7

1.0

Ven

1.8 ± 0.3

3.4 ± 0.6

0

0

0

Mean±standard error

 

 

3. 토양순화

대기순화 유무에 따른 발근유도를 통해 정상적으로 자란 개체를 대상으로 특별한 습도조절 없이 24±2℃ 조건에서 3일 간격으로 충분히 관수하며 토양순화를 4주간 거친 결과 모든 조건에서 완전히 활착한 백하수오를 관찰 할 수 있었으며 95%이상 생존하였다.

 

 

결 론

본 연구는 우량 및 무균 야생 백하수오를 식물생명공학기술을 적용하여 실제 재배에 공급하고 자생식물자원보존 및 자료축적을 위한 기초연구로 수행하여 일련의 배양과정을 통해 대량생산의 가능성을 확인하였으며 얻어진 결과는 다음과 같다. 액아를 이용한 다경유도 시 1/2 MS 배지에 3% glucose, 1.0 mg/L KIN이 첨가된 환기 처리구에서 2.8개로 가장 많이 발생하였으며 뿌리유도는 1/2 SH배지에 0.2% AC, 3% glucose, 1.0 mg/L NAA가 첨가된 대기순화 무 처리구에서 41.7%의 유도율을 확인하였으며 토양순화 시 95%의 생존율을 보여 실생 발아 한 개체와 유사하게 성장하는 것을 확인하였다. 추후 기내 배양식물체의 발근율을 높이기 위한 연구가 진행되어야 한다. 따라서 본 연구를 활용하여 보다 효율적인 대량생산체계를 확립하고 개량육종, 우량품종 개발 및 효율적인 식물자원보존 등을 기대하는 바이다.

인용문헌

 

 

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39. 허준. 1994. 동의보감. 학력개발사. 서울. pp. 1195.

 

 

유도규  산림자원학과 4학년

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